5 Geheimnisse in Bezug auf Herkunft CRISPR

Francisco Mojica war nicht der erste, der die CRISPR sah, aber wohl der erste war er überrascht. Er erinnert mich an dem Tag im Jahr 1992, als ich zum ersten Mal an dem mikrobiellen Immunsystem sah, dass die Biotech-Revolution führen könnte. Er betrachtete die Genomsequenzdaten halophytic Mikrobe Haloferax mediterranei und 14 beobachtet ungewöhnliche DNA-Sequenzen von 30 Basen jeweils der Länge. Sie wiederholen alle 35 Basen oder so. Bald fand er diese mehr. Mojica war fasziniert und den Trick in der Studie an der Universität von Alicante in Spanien wiederholt.

Seine wenigen unterstützt. Das Labor ist seit Jahren ohne Finanzierung gearbeitet. In den Sitzungen Mojica versucht, die Hülse des größten Namen zu fangen und fragen, was sie dachte an den seltsamen kleinen Wiederholungen. „Seien Sie nicht so viele Sorgen um dich wieder“, antwortete sie. „In vielen Organismen gibt es eine Menge Wiederholung - wir kennen sie für eine lange Zeit, aber nicht wissen, wie viele von ihnen zu arbeiten.“

Heute über kurze Palindrom wiederholt, regelmäßig angeordneten Bänder (CRISPR), bekannt viel mehr, und sie helfen, das Immunsystem zu bakteriellem CRISPR-Cas eindringende Viren zerstören. Obwohl die meist biomedizinischen System Mechanik erkannt - zum Teil wegen der Version des CRISPR-Cas9, die verwendet wird, Gene zu bearbeiten - Mojica und andere Mikrobiologen können immer noch nicht einfache Fragen über das System beantworten und wie es funktioniert. Wie es entwickelt, um die Auswirkungen auf die mikrobielle Evolution? Warum einige Mikroben es und andere nicht? Kann sie andere, noch nicht erfassten Rolle in grundlegender Biologie sein?

„In den Medien viel Aufmerksamkeit CRISPR Systeme, indem es als Technologie - und das nicht ohne Grund. Wir sehen hier einen großen Einfluss und Chancen „, sagt Jennifer Dudna, Molekularbiologe an der University of California in Berkeley, einer der ersten Wissenschaftler, für die Bearbeitung des Genoms möglich CRISPR-Cas als Werkzeug aufzudecken. „Zur gleichen Zeit gibt es viele interessante Forschung in grundlegender Biologie, die noch zu tun bleibt.“

Wo kommt er her?

Biologische Vorteile von so etwas wie CRISPR-Cas offensichtlich. Prokaryoten - Bakterien und weniger bekannte Einzeller Archaea genannt, von denen viele unter extremen Bedingungen leben, sind ständig mit dem Ansturm der genetischen Eindringling konfrontiert. Viren zahlreicher als Eukaryoten zehnmal und alle zwei Tage die Hälfte der Bakterien Welt töten. Prokaryoten ausgetauscht auch Partikel von DNA-Plasmide, die parasitären sein kann - sie Ressourcen aus seinem Wirt saugen und es selbst zu zerstören machen, wenn er mit einem Molekular Begleiter zu vertreiben versucht. Es scheint, dass die Sicherheit nicht überall vorhanden ist: vom Land zum Meer und die unwirtlichsten Orten auf unserem Planeten, genetische Eindringlinge sind überall.

Prokaryoten entwickelt und erwarb eine Waffe mit diesen Bedrohungen fertig zu werden. Restriktionsenzyme, wie zum Beispiel sind Proteine, die an oder nahe einer spezifischen DNA-Sequenz geschnitten. Jedes Enzym ist programmiert, um spezifische Sequenzen zu erkennen, und die Mikrobe geschützt ist nur, wenn es eine Kopie des Gens aufweist. CRISPR-Cas ist viel dynamischer. Sie paßt und speichert bestimmte genetische Eindringlinge sowie menschliche Antikörper bieten langfristige Immunität nach der Infektion. „Als wir zum ersten Mal von dieser Hypothese gehörten, dachten wir, dass es für eine einfache Prokaryonten zu schwierig sein sollte“, sagt Biologe John van der Oost von der Universität Wageningen in den Niederlanden.

Mojica und andere CRISPR-Cas-Funktion abgeleitet wird, wenn gesehen, dass die Abstände zwischen dem DNA palindromisch repeats manchmal CRISPR-Sequenzen in den viralen Genomen entsprechen. Seitdem fanden die Forscher, dass bestimmte CRISPR-assoziierten (CAS), diese Proteine ​​wurden zugegeben Raumsequenzen (Spacer) an das Genom nach den Bakterien und Archaea auf bestimmte Viren oder Plasmiden ausgesetzt sind. RNA aus diesen Spacern lenkt andere Proteine ​​Cas-angreifen jede eindringende DNA oder RNA mit einer Sequenz entspricht. Als Bakterien und Archaea wurde so Immunsystem kompliziert? Diese Frage ist zu beantworten, aber die führende Theorie ist, dass diese Systeme von Transposons abgeleitet sind - „jumping genes“, die von einer Position zur anderen im Genom springen. Der Evolutionsbiologe Eugene Kunin von den US National Institutes of Health in Bethesda, Maryland, und seine Kollegen haben eine Klasse von mobilen genetischen Elemente gefunden, die ein Protein CAS1 kodieren, die bei der Schaffung der Abstandshalter in das Genom beteiligt ist. Diese „kaspozony“, schlägt er vor, kann der Beginn der Immunität CRISPR-Cas. Nun arbeiten die Wissenschaftler zu verstehen, wie diese DNA-Segmente von einem Ort zum anderen springen - und dann verfolgen, wie dieser Mechanismus zu einer Komplikation der CRISPR-Cas führen könnte.

Wie funktioniert es?

Viele der molekularen Details, wie die Cas-Proteine ​​hinzugefügt Abstandhalter gut in der letzten Jahren untersucht worden. Allerdings ist die virale DNA chemisch fast identisch mit dem Wirts-DNA. Wie in der Zelle mit DNA-Proteinen werden lernen, wie DNA, die Erinnerung an CRISPR-Cas hinzufügen?

Die Einsätze sind hoch: wenn das Bakterium einen Teil seiner eigenen DNA hinzufügt, besteht das Risiko von Selbstmord, Autoimmunangriff, sagt Vidzhiniyus Siksnis, Biochemiker an der Universität Vilnius in Litauen. „Diese Enzyme sind obodoyustrym Schwert.“

Es ist möglich, dass die Bevölkerung von Bakterien und Archaea einige Fehler aufnehmen können, sagt Rodolphe Barrangou, ein Biologe an der North Carolina State University in Raleigh. Mehrere Zelle Selbstmord Materie kann nicht, wenn die anderen Zellen nach einem Virenangriff leben.

In der Tat, wenn die Viren das bakterielle Ökosystem eindringen, oft nur ein Bakterium der 10 Millionen erhielt es einen Abstandshalter, so dass sie sich verteidigen. Diese erschweren die Chancen für die Untersuchung der Entstehung dieser Abstandshalter, sowie das Verständnis, warum manche Zellen gelingen, während andere scheitern. „Es ist schwer, ein Bakterium zu fangen, wenn es wirklich passiert“, sagt Luciano Marrafini, Mikrobiologe an der Rockefeller University in New York. Die Sortierung kann bei der Bestimmung der entsprechenden Abstandshalter nützlich sein - und Einschlussrate erhöht. Einige Studien haben gezeigt, dass Zellen enthalten Mechanismen CRISPR-Cas, als eine andere Art von Aufzeichnungsvorrichtung dienen könnte, Katalogisierung DNA und RNA-Sequenzen, die auftreten. Dies kann ermöglichen, Wissenschaftler, die Expression von Zell-Gen oder Umweltbelastung über die Zeit zu überwachen.

Die Forscher wollten auch wissen, wie alte Erinnerungen aus der Sammlung abgerufen werden. Die meisten Mikroben CRISPR-Cas-Systeme enthalten nur ein paar Dutzend der Abstandshalter; einige - nur eine. Archeia Sulfolobus tokodaii, im Gegenteil, widmet 1% seines Genoms Systems 5 CRISPR-Cas, umfassend Abstandshalter 458.

Vielleicht nicht so viel Anreiz, den alten Abstandshalter zu halten: wenn das Virus mutiert das CRISPR-Cas zu umgehen, wird der Abstandhalter überflüssig. Und es kann eine Belastung für die Mikroben, die die zusätzliche DNA zu retten versuchen. „Das Bakterium ihr Genom immer nicht aufblasen kann“, sagt Rotum Sorek, Genetiker am Weizmann Institut in Rehovot, Israel.

Was kann er tun?

Der Ursprung einiger der Abstandshalter ist ein weiteres Rätsel. Weniger als 3% der beobachteten momentan Abstandshalter entsprechen einigen bekannten Sequenzen in der DNA-Datenbanken.

Dies kann reflektieren, wie wenig wir über das Virus wissen. Die meisten Versuche, die Sequenzierung wurden mit denen gewidmet, die Menschen, Nutztiere oder Nutzpflanzen infizieren. „Wir wissen sehr wenig über diese Feinde von Bakterien und vor allem über die Feinde des Landes Archaea“, sagte Michael Seeschwalben, RNA Biologe an der Universität von Georgia in Athens.

Es ist auch möglich, dass einige Abstandshalter Geister Viren sind, die nicht mehr existieren, oder die bis zur Unkenntlichkeit mutiert ist. Aber es gibt eine dritte Möglichkeit, die wie ein Wissenschaftler. Forscher fanden heraus, Beispiele dafür, wie das CRISPR-Cas System viel mehr getan, als nur mit genetischen Bösewichten kämpfen. Einige bakteriellen Komponenten CRISPR-Cas gesteuert DNA Reparatur, die Genexpression und die Bildung von Biofilmen. Sie könnten auch die Fähigkeit der Bakterien bestimmen, andere zu anstecken: Leginella pneumophila, verursacht Legionärskrankheit, war es Cas-Protein CAS2 zu haben, die Amöbe zu infizieren, ohne seine natürliche Unterstützung ist. „Die große Frage ist, wie viel Biologie über den Umfang des Schutzes geht“, sagte Eric Sonteymer, Molekularbiologe an der Universität von Massachusetts. „In den kommenden Jahren wird eine Menge neuer Informationen sein.“

Sonteymer fügt hinzu, daß all dies bildet einen neugierigen parallel mit der Entdeckung der RNA-Interferenz - ein System, das die Expression von Genen in Pflanzen, Tiere und andere Nicht-Prokaryonten unterdrückt. RNA-Interferenz auch in erster Linie als Abwehrmechanismus angesehen, aber nur dann bemerkt Forscher ihre Rolle bei der Regulation der Genexpression Träger.

Es könnte auch erklären, warum manche Abstandshalter nicht bekannte Viren oder Plasmide entsprechen, sagt Stan Braun, ein Biologe an der Technischen Universität Delft in den Niederlanden.

„Diese Systeme sind nicht perfekt zu sein konfiguriert: sie die virale DNA greifen, sowie ihre eigenen“, sagt er. „Sobald sie beginnen, neue DNA-Stücke zu gewinnen, können sie neue Features erhalten - wenn Sie nicht sterben.“

Warum alle nicht die Mikroben es verwenden?

Unabhängig von den anderen Funktionen, die ein CRISPR-Cas hat, ist es offensichtlich, dass einige Mikroben es verwenden mehr als andere. Mehr als 90% Immun Archaea CRISPR-basiert ist, während nur ein Drittel der sequenzierten Bakterien mit ihm toben, sagt Kunin. Und unter dem nicht prokaryotischen sogar Einzeller, nie Verwirrung gesehen CRISPR-Cas.

Einer der Archaikum, Nanoarchaeum equitans, lebt als Parasit auf andere Archean in fast kochendem Wasser und mit ihm teilten viele der Gene, die mit der Energieerzeugung und allgemeine Wartung der Heimatzelle Wirtschaft verbunden. Dennoch in seinen winzigen 490 000 beschrifteten DNA Anweisungen, equitans N. hält in dem CRISPR-Cas-System, etwa 30 Spacer. Ein großer Teil seines Genoms, sie widmet CRISPR. Es stellt sich heraus, kann CRISPR sehr wichtig sein, aber die Wissenschaftler noch nicht wissen, warum. Diese Unterschiede deuten darauf hin, dass es wichtige Umweltfaktoren, die zur Entwicklung des CRISPR-Cas-Systems und es vorziehen, zu Virenschutz beitragen - oder anderen Vorteilen - trotz der Bedrohung durch zellulären Selbstmord, sagt Edge-Westra, ein Biologe an der University of Exeter in Großbritannien. Extreme Bedingungen scheinen ein Leistungssystem CRISPR-Cas zu spielen, aber Västra stellt fest, dass die Häufigkeit solcher Systeme auch bei Bakterien in dem besseren Lebensraum variiert. Avian Erreger Mycoplasma gallisepticum, zum Beispiel, gab sein Inventar CRISPR-Cas, wenn sie von Hühnern zu wilden Finken geschaltet. Warum ist dieses System für die Vögel war nützlich, aber nicht für die Finken, können wir nur vermuten.

Mathematische Modelle und die ersten Laborversuche zeigen, dass das CRISPR-Cas kann ein Vorteil sein, aber wenn er mit nur wenigen Arten von Viren zu bekämpfen. Spacers CRISPR-Cas kann eine begrenzte Anzahl von viralen Sequenzen aufzuzeichnen, bevor die DNA Genomics Belastung hinzugefügt wird. Wenn die Vielfalt der Viren in der Umwelt stark die Anzahl der möglichen Abstandshalter überschreitet, CRISPR-Cas System keine korrekte Anwendung findet, sagt Kunin. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Archaeen in extremen Umgebungen kann nicht richtig auf andere Mittel angewiesen. Einer der häufigsten Wege, mit Eindringlingen in Bakterien zu tun - eine Mutation von Proteinen in der Umwelt in ihrer eigenen Haut. In Archaeen möglicherweise nicht so viele Möglichkeiten Mutation der äußeren Schale sein, weil es ein bisschen zu anderen Zwecken dient insbesondere zum Schutz vor aggressiven Umgebungen, so kann das CRISPR-System besser geeignet sein.

Wie viele Arten von CRISPR-Cas?

Die Menschen wählten in der Bearbeitung des Genoms CRISPR-Cas9 System für seine Einfachheit und Vielseitigkeit, aber Mikroben Favoriten nicht holen. Stattdessen neigen sie verschiedene Systeme zu mischen und anzupassen, schnell neue andere Bakterien aufzunehmen und die alten zu verlassen.

Forscher haben offiziell 6 verschiedene Arten von CRISPR-Systemen mit 19-Subtypen erkannt. „Und in der Tat, wir wissen, wie nur zu arbeiten, einen Teil von ihnen“, sagen die Wissenschaftler.

Die Offenlegung dieser Mechanismen könnte den Schlüssel für die Suche nach neuen biotechnologischen Anwendungen CRISPRS-Cas-Systemen bieten. Liebes System CRISPR-Cas9, zum Beispiel, ist ein System des Typs II. Aber es gibt noch Typen III, IV, V, VI und andere.

Typ-III-System wird am häufigsten in der Natur - und verstand weniger als die andere. die neuen Systeme zu verstehen, wird die Reihe von Werkzeugen für die Bearbeitung des Genoms erweitern.

Mojica zu studieren Vielfalt und die Suche nach Antworten auf grundlegende Fragen über die CRISPR-Systeme ist mehr als die Attraktivität der Revolution, können sie beginnen. Er stürzte sich in die Biologie von CRISPR-Cas 25 Jahre her, und zwar für diejenigen, die mit dem Wechsel in das Genom basteln wollen nun alle finanziellen Ressourcen öffnen, sie sind viel weniger als für diejenigen, die in rein Theorie beschäftigt sind.

„Ich weiß, es ist ein großes Werkzeug. Er ist unglaublich. Es kann zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden „, sagte Mojica. „Aber es ist nicht mein Geschäft. Ich möchte wissen, wie das System von Anfang an bis zum Ende funktioniert. "